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上一期小編推出烈冰生物關鍵技術——冷凍切片制備之后，很多老師都表示很感興趣，銷售部同事訂單直線增加。小編整理售前答疑的過程中，發(fā)現(xiàn)有老師們對樣本準備階段有很多疑問。那么，本期小編就來詳細介紹一下空間轉錄組（Spatial Transcriptome）樣本制備過程的具體問題，提供詳細的樣本準備指南，助力每一份珍貴的樣本都能順利進行空間轉錄組實驗。
烈冰可接受樣本類別：凍存組織，OCT包埋組織。如果樣本充足，最好準備2份及以上，一份用于RNA質控和后續(xù)的正式切片實驗；一份留作備用；如果組織樣本珍貴稀缺，可以酌情減少樣本數(shù)量。
我們請到了烈冰實驗團隊大神Dr.Han親自上手，針對小鼠的不同組織進行實驗，不斷對樣本制備操作步驟進行優(yōu)化， 為老師們實際操作排雷填坑。
空間轉錄組visium捕獲芯片的限制（6.5mmX6.5mm），選擇樣本前，應先確認好最佳取材位置以及合理組織大小，保證visium芯片的有效利用率。
新鮮組織樣本取下后迅速用預冷的PBS溶液或者生理鹽水沖洗組織表面殘留，然后用干凈的吸水紙吸干液體。（此步驟一定要吸干水分，如有液體殘留，OCT包埋后，組織表面形成冰晶，影響切片效果）
整個樣本處理過程需要保持低溫環(huán)境（干冰/液氮）
先將裝異戊烷的容器放置液氮中預冷15分鐘,同時將所有過程中的采集器具進行預冷。
用預冷的樣本匙將新鮮組織浸沒在異戊烷中.速凍1min或直至組織完全冷凍。
采用異戊烷而不是液氮的原因是液氮的沸點低，組織直接放入液氮后會沸騰，在組織周圍產生氣穴，導致組織降溫過程中不同區(qū)域降溫不同，改變組織內部形態(tài)甚至碎裂，影響組織形態(tài)。因此該步驟一定要用異戊烷進行凍存，如果沒有異戊烷，可以跳過該步驟，直接將新鮮組織進行OCT包埋后速凍。
在包埋模具中加入一層OCT包埋劑，然后用預冷的鑷子迅速將組織放入；
用OCT覆蓋組織，使之完全包埋住。確認組織周圍沒有氣泡；立即將其放在干冰上，直至OCT完全凍結。該步驟要保證最終組織周圍無氣泡產生，氣泡的產生會在OCT冷卻后在組織周圍形成空洞，影響切片效果。
切片厚度一般設定為10μm，但是根據(jù)不同的組織類型，切片厚度也會有所調整。例如脂肪含量較高的乳腺組織可能需要更厚的切片。
切片溫度一般設定為箱體溫度：-20℃，樣本頭溫度：-10℃。不同的組織類型，樣品頭溫度會有所調整，以保證切片的光滑完整性。
切片之前需要將質檢合格的冷凍組織和玻片先放入-20℃冷凍切片機箱體中平衡30分鐘以上。
烈冰針對不同的組織類型，進行了不同切片厚度、切片溫度的嘗試與探索，優(yōu)化出一系列可調整參數(shù)。整個切片過程烈冰實驗團隊會與老師保持密切溝通進行溝通，以保證獲取高質量的冷凍切片。
質控I：RIN值檢測，RIN值>7進行后續(xù)實驗，保證組織的RNA完整。
如果送樣充足，可以針對組織塊進行RNA抽提檢驗；
如果樣本珍貴，也可以在正式冷凍切片前切取一定量的切片進行RNA抽提檢測。
為了最大程度減少樣本的損失，并保證實驗的有效性，烈冰實驗團隊針對小鼠不同組織，根據(jù)組織大小、切片厚度，對20張切片的RNA總量進行統(tǒng)計，對正式實驗中質控所需的切片數(shù)量起到參考作用，避免造成浪費。
質控II：HE染色成像，保證冷凍切片的空間結構的完整性。前期樣本準備實驗操作失誤會嚴重影響冷凍切片的空間組織形態(tài)。
新鮮組織樣本如果表面液體沒有吸干，直接進行凍存切片會在組織周圍產生冰晶，增加組織脆性，不易切片成功，或者HE染色成像后出現(xiàn)條狀裂紋。
OCT包埋如果不注意處理氣泡，切片時會出現(xiàn)空洞現(xiàn)象，造成切片不連續(xù)，影響切片質量。
冷凍切片時必須保證切片無褶皺、光滑平整，組織無折疊、卷曲。
讓我們一起抓住空間轉錄組的熱潮，應在高分文章起跑線，快來聯(lián)系我們吧。烈冰生物將竭誠為您提供優(yōu)質的空間轉錄組測序研究完整的解決方案！
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