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Small RNA Sequencing
Small RNA主要包括miRNA、piRNA、tsRNA（tRF&tiRNA）、snRNA和snoRNA等，是一類不具有蛋白編碼能力的RNA分子，能調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞生長、發(fā)育和代謝等基礎(chǔ)生物學(xué)過程中都扮演著重要的角色，甚至在癌癥等相關(guān)疾病形成過程中也起著關(guān)鍵的作用。高通量測(cè)序技術(shù)省去了煩瑣的Small RNA克隆文庫構(gòu)建過程，可以一次性生成上百萬條Small RNA序列，能夠快速鑒定特定條件下表達(dá)的已知Small RNA并發(fā)現(xiàn)新的Small RNA，同時(shí)還可以研究不同條件下Small RNA的表達(dá)差異，并可以聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
A workflow for Small RNA Sequencing
Jai PM et al., RNA Mapping, 2014
1. 針對(duì)動(dòng)物（包括外泌體）Small RNA（miRNA、piRNA、tsRNA）提供定制化實(shí)驗(yàn)分析方案;
2. 不僅能高效準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)并注釋非模式物種新的miRNA，還能進(jìn)行piRNA、tiRNA、tRF等最新的研究；
3. 及時(shí)更新miRBase、miRanda、RNAhybrid等專業(yè)miRNA數(shù)據(jù)庫以及靶基因預(yù)測(cè)算法，保證分析結(jié)果緊跟行業(yè)前沿。
組織樣品：
1. 動(dòng)物組織：>200mg；
2. 植物組織：>200mg；
3. 細(xì)胞培養(yǎng)：>2x106個(gè)；
4. 全血：>3ml；
5. 菌體：>2x106個(gè)或>300mg。
RNA樣品：
1. 請(qǐng)?zhí)峁w積15 μL - 100 μL，總量≥10μg，濃度≥ 200ng/μL的RNA；
2. OD260/280介于1.8~2.2之間，OD260/230≥2.0，RIN≥6.5，28S:18S≥1.0，確保RNA無降解；
3. 送樣時(shí)請(qǐng)標(biāo)記清楚樣品編號(hào)，管口使用Parafilm膜密封；
4. 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融；
5. 送樣時(shí)請(qǐng)使用干冰運(yùn)輸。
不同樣品之間存在差異，詳情請(qǐng)向烈冰咨詢
1. 總RNA提取及質(zhì)控：RNA總量 > 1 μg ；RIN> 6.0
2. 小RNA富集：切膠范圍10-50bp
3. 小RNA質(zhì)控：Agilent 2200質(zhì)控
4. 文庫構(gòu)建：文庫分子18-30bp
5. 上機(jī)測(cè)序：Small RNA測(cè)序NovaSeq、HiSeq、Ion Proton等測(cè)序儀都可以完成。測(cè)序數(shù)據(jù)量40M reads。
>>動(dòng)物小RNA
堿基質(zhì)量結(jié)果圖（過濾后）
注：橫坐標(biāo)表示堿基位點(diǎn)，縱坐標(biāo)表示堿基質(zhì)量值。
small RNA長度分布情況
注：左圖為miRNA長度分布圖；右圖為piRNA長度分布圖。
small RNA堿基偏好性分析
注：橫坐標(biāo)表示序列長度，縱坐標(biāo)表示百分比，不同顏色表示不同的核苷酸。
miRNAs表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析
An X et al., Theriogenology, 2016
注：該表格列舉了部分差異miRNAs的名稱和序列信息，NE（normalized expression）表示標(biāo)化后的miRNA表達(dá)量。
差異miRNAs熱圖
An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015
注：橫軸表示組別，縱軸表示不同miRNAs。
miRNA靶基因功能和pathway網(wǎng)絡(luò)圖
An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015
注：該圖表示miRNA-204靶向的基因，及其靶基因所顯著富集的GO條目（右）和Pathway條目（左）。
novel miRNAs的莖環(huán)結(jié)構(gòu)
An X et al, Theriogenology. 2016
注：該圖展示了進(jìn)一步分析與已知miRNA不匹配的測(cè)序reads預(yù)測(cè)的新的miRNA，這10個(gè)序列都具有顯著的莖-環(huán)發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)。
miRNAs靶基因網(wǎng)絡(luò)圖
An J et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2015
注： 綠色表示下調(diào)的miRNAs，紅色表示上調(diào)的miRNAs。
DCs分化過程中miRNAs表達(dá)情況
Su XP et al., Nature Communications, 2013
注：該圖展示了DCs分化過程中miRNAs表達(dá)情況。H、I、M和R分別代表分化的四個(gè)階段：H—HSCs；I—imDCs；M—maDCs；R—DCreg，左上角的數(shù)字代表將391個(gè)miRNAs分成了26個(gè)clusters，左下角的數(shù)字代表每個(gè)cluster中miRNAs的數(shù)量，有顏色的clusters代表miRNAs顯著富集。
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