在單細胞轉錄組測序分析專題前兩期的講解中，小編已經(jīng)為大家介紹了數(shù)據(jù)的質控、標準化和聚類，以及細胞類型的鑒定，不知道大家是否還記得這個細胞類型鑒定的圖呢？

鑒定好細胞類型后，我們還可以對其進行一些功能性分析，如擬時序分析和SCENIC分析，對細胞的生物學意義進行一定程度上的挖掘。本期小編主要為大家介紹擬時序分析（Pseudotime Analysis）。

1、Q & A環(huán)節(jié)

Q1：我們?yōu)槭裁匆M行擬時序分析？？

l 機體為響應各種應激，其細胞會從一種功能“狀態(tài)”轉變?yōu)榱硪环N功能“狀態(tài)”；

l 當細胞在不同狀態(tài)之間轉變時，往往會經(jīng)歷轉錄重組，導致一些基因被沉默，一些基因被重新激活，但純化這些瞬態(tài)細胞進行研究是很困難或不可能的；

l ScRNA-seq擬時序分析可以讓我們在不需要純化的情況下查看這些細胞狀態(tài)。

Q2：ScRNA-seq擬時序分析是什么？？

擬時序分析，即根據(jù)不同細胞亞群基因表達量隨時間的變化情況，構建細胞譜系發(fā)育，但這里的時間并不是真時間，而是一個虛擬的時間，是指的細胞與細胞之間的轉化和演替的順序和軌跡。

l 即使在同一個樣本中，也會存在多種不同的細胞形態(tài)。因此，不論測定了多少樣本，我們都可以采用擬時序分析對樣本中的細胞轉化和變化進行描述。

Q3：擬時序分析用的工具是啥？它能進行哪些分析？

l Monocle是用于ScRNA-seq擬時序分析的經(jīng)典工具（R包），目前已更新至3版本；

l Monocle是使用算法來學習細胞狀態(tài)轉變過程中每個細胞必須經(jīng)歷的基因表達變化序列，一旦了解了基因表達變化的整體“軌跡”，Monocle就可以將每個細胞放置在軌跡中的適當位置。

l 我們可以使用Monocle中的相關分析工具做Beam分析（Branch Expression Analysis Modeling），揭示重要的基因和細胞。

（算法參考文獻：Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories.）

2、烈冰擬時序分析工作流搭建

3、擬時序分析結果解讀

對于擬時序分析來說，研究某一特定細胞類型的轉化，如M1/M2型巨噬細胞極化、CD8⁺ T細胞激活和耗竭等等，往往具有一定的生物學意義。這里小編通過對上期T細胞進行亞群鑒定，以CD8⁺ T細胞亞型為例進行擬時序分析（圖1）。

圖1 CD8⁺ T細胞亞群鑒定流程

（1）CD8⁺ T細胞樹形結構軌跡

圖2 CD8⁺ T細胞樹形結構軌跡

圖中每個點代表一個細胞，具有相似狀態(tài)的細胞被聚到一起，每個分支點代表一個可能的細胞生物學過程決策點（該例圖中只有1個分支點）。圖2展示了CD8⁺ T細胞每個cluster在偽時間軸上的分布，不同顏色代表不同cluster。我們這邊通過對每個cluster進行細胞類型鑒定，初步將cluster 2/3/6鑒定為記憶T細胞，cluster 7鑒定為Na?ve T細胞。

（2）CD8⁺ T細胞所處分化時間軌跡

Monocle基于離默認偽時間軸起點的遠近，將細胞排布如圖3所示。在該圖中顏色越深代表默認的起點，顏色越淺表示離偽時間軸起點越遠。注意：這邊的起點是monocle算法計算出來的，而非實際真正的起點。

圖3 CD8⁺ T細胞所處分化時間的軌跡圖

以該例圖為例，我們結合每個分支（共3個分支）中的cluster類群是否高表達CD8⁺ Na?ve T細胞相關Marker（如LEF1、SELL和CCR7等）, 耗竭性T細胞相關Marker（如LAG3、HAVCR2、CD27、TIGIT等），以及細胞增殖相關Marker（如MKI67、TOP2A、CCNB1等），將起始狀態(tài)鑒定為Na?ve T細胞，終末狀態(tài)為耗竭性（Cell fate 1）和增殖型（Cell fate 2）T細胞。

（3）Beam分析

確定了分化起點后，Monocle可以模擬出每個細胞所處的分化時間，并尋找隨著分化時間逐漸升高或降低的基因表達熱圖和分布圖，即Beam分析。圖4將Top200差異基因聚成4類，展示了pre-branch向cell fate1和cell fate2狀態(tài)分化相關的命運決定基因。圖5展示了與細胞增殖相關的基因，如MKI67和TOP2A在cluster 5中高表達，提示cluster 5作為CD8⁺ Na?ve T細胞終末分化狀態(tài)是一種增殖型細胞（Proliferating）。除此之外，如果有特別關注的基因也可以基于關注的基因進行繪制。

圖4 擬時序Beam分析基因表達熱圖

圖5 擬時序Beam分析基因表達分布圖

總的來說，通過對CD8+T細胞亞型進行擬時序分析得到了CD8+ T細胞的分化軌跡，進行Beam分析可以幫助得到與狀態(tài)分化相關的命運決定基因。以上，就是本期單細胞測序數(shù)據(jù)分析——擬時序分析的全部內(nèi)容，敬請期待下期SCENIC分析的精彩內(nèi)容～