單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-Seq）

已成為目前最炙手可熱的科研技術(shù)之一，在揭示細胞間狀態(tài)、轉(zhuǎn)變和細胞間差異表達中有重要的意義。目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤、神經(jīng)、發(fā)育等領(lǐng)域。

2021 年 1 月，上海長海醫(yī)院任善成教授與加拿大多倫多大學(xué) Housheng Hansen He 教授、復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院王建華教授合作在 Nature Cell Biology 雜志發(fā)表了題為「Single-cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression」論文。

（圖片來源：Nature Cell Biology）

文章通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，解析了前列腺癌腫瘤微環(huán)境的高度異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)了臨床病理和影像學(xué)無法識別的微轉(zhuǎn)移灶，還揭示了癌細胞通過外泌體的方式馴化免疫細胞轉(zhuǎn)錄組使其表達腫瘤基因，這些都對前列腺癌治療靶點的確定和侵襲性腫瘤生物標(biāo)志物的研發(fā)開拓了思路。

下文由負責(zé)這篇文章單細胞生物信息學(xué)分析的作者，來自烈冰生物的張博撰寫，主要針對單細胞測序如何應(yīng)用于腫瘤研究，如何設(shè)計實驗樣本、分析研究數(shù)據(jù)等問題進行解析。

一、文章概覽

烈冰生物參與了單細胞測序中樣本設(shè)計和單細胞消化、分選測序?qū)嶒?，以及?shù)據(jù)分析、生物信息學(xué)意義挖掘的工作。

二、研究結(jié)果展示

通過對 Batch1 進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，注釋細胞類型主要包括上皮細胞、單核-巨噬細胞系、T 細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、肥大細胞等主要群體。然后分別對每個大群進一步分析。

Fig.1 13 例前列腺癌樣本的單細胞研究概況

（圖片來源：Nature Cell Biology）

1. 與腫瘤預(yù)后相關(guān)的上皮細胞類型

通過拷貝數(shù)變異分析、腫瘤細胞的 marker 基因/信號通路相關(guān)性分析，將上皮細胞鑒定為 luminal types、cell-cycle 、basal/intermediate 類型；我們主要研究了這些細胞類型與臨床預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)特異性表達細胞因子 CCL2 的 basal/int. 亞群與前列腺癌有較好的預(yù)后關(guān)系；而 cell-cycle 細胞亞群則與前列腺癌預(yù)后呈負相關(guān)。

Fig.2  上皮細胞與 maker 基因相關(guān)性打分情況

（圖片來源：Nature Cell Biology）

Fig.3  TCGA 預(yù)后關(guān)聯(lián)性分析

（圖片來源：Nature Cell Biology）

2. 單細胞測序發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移潛在機制和微轉(zhuǎn)移灶

在 T 細胞的研究中，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，T 細胞竟然表達前列腺癌特異性基因 KLK3，深入挖掘分析多種類型的單細胞公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn) T 細胞均表達相應(yīng)的腫瘤標(biāo)記基因的廣泛特征。

接下來，以 KLK3 為中心，進行了基因與亞群功能相關(guān)性分析、基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn) KLK3 與細胞外囊泡（EV）和外泌體 PSA 相關(guān)通路被激活，這提示我們腫瘤可能通過分泌 EV 介導(dǎo) KLK3 轉(zhuǎn)移至 T 細胞并降低其殺傷功能，為了證明該途徑的可行性，我們反復(fù)通過流式分選、RNA 熒光原位雜交、免疫組化等驗證實驗，發(fā)現(xiàn)了表達 PSA/KLK3 的 T 細胞，進一步證實腫瘤細胞通過外泌體馴化 T 細胞使其表達與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤標(biāo)記基因。

Fig.4  T 細胞表達前列腺癌特異性抗原 PSA

（圖片來源：Nature Cell Biology）

那 EV 轉(zhuǎn)移是否會影響附近淋巴結(jié)（LNs）以及影響程度如何呢？我們又設(shè)計了前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本（Batch2）進行單細胞測序，同樣地發(fā)現(xiàn)所有腫瘤樣本的 T 細胞普遍高表達 KLK3。

有趣的是，其中一例前列腺癌患者的 MRI 影像及術(shù)后病理均提示左右兩側(cè)髂外淋巴結(jié)為陰性，而 scRNA-Seq 細胞亞群統(tǒng)計顯示右側(cè)淋巴結(jié)組織中存在高表達 KLK3 的 T 細胞，提示這可能已經(jīng)形成了「轉(zhuǎn)移前癌巢」結(jié)構(gòu)；而左側(cè)淋巴結(jié)組織中不僅存在高表達 KLK3 的 T 細胞，還存在惡性上皮細胞，即左側(cè)淋巴結(jié)已發(fā)生了臨床無法識別的微轉(zhuǎn)移灶。

除了這一發(fā)現(xiàn)，我們還注意到 Batch2 樣本采用 BD Rhapsody 平臺進行單細胞分選時，我們分析存在一群中性粒細胞，而 Batch1 樣本采用 10X Genomics 分選平臺的數(shù)據(jù)中沒有分析到中性粒細胞的存在。

Fig.5  單細胞測序發(fā)現(xiàn)臨床和影像學(xué)無法識別的微轉(zhuǎn)移灶

（圖片來源：Nature Cell Biology）

3. 基質(zhì)細胞的分析模式

我們從 signature 基因、pathway 和轉(zhuǎn)錄因子等多角度完整描述了基質(zhì)細胞的高度異質(zhì)性，并在內(nèi)皮細胞（EC）中發(fā)現(xiàn)有一部分高表達腫瘤相關(guān)性成纖維細胞（CAF）的相關(guān)特征基因，將其命名為激活的內(nèi)皮細胞（aECs）。通過細胞通訊分析，發(fā)現(xiàn) aEC 與上皮細胞有強作用關(guān)系，提示其可能影響腫瘤的進展。

Fig.6  aEC 與上皮細胞有強作用關(guān)系

（圖片來源：Nature Cell Biology）

于是，重新設(shè)計 11 例不同時期前列腺癌樣本（Batch3），分選出內(nèi)皮細胞進行單細胞測序，通過擬時序分析發(fā)現(xiàn) aEC 細胞大部分均來源于 CRPC 樣本，其亞群占比隨腫瘤進展至 CRPC 而逐步升高，表明 aEC 細胞亞群與前列腺癌惡性進展為 CRPC 密切相關(guān)。

我們利用流式分選，證明了大部分 aEC 細胞亞群來自于 CRPC 樣本；通過共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn) aEC 細胞亞群能夠提高前列腺癌細胞的侵襲能力，這些實驗都證實了 aEC 這一細胞亞群在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。

Fig.7  aEC 占比與前列腺癌惡性進展密切相關(guān)

（圖片來源：Nature Cell Biology）

三、總結(jié)

我們通過巧妙地實驗樣本設(shè)計、深入地 scRNA-Seq 數(shù)據(jù)分析和驗證實驗，闡述了前列腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子機制，并發(fā)現(xiàn)了一群與腫瘤進展相關(guān)的新細胞亞型，對前列腺癌新型治療策略和預(yù)后指導(dǎo)具有重要意義。

我們整理了一些細胞群體數(shù)據(jù)收錄進 NovelBrain 單細胞瀏覽器中,方便大家搜索關(guān)注的基因。

您也可以登錄www.pradcellatlas.com網(wǎng)址，下載獲取本文中數(shù)據(jù)，進行數(shù)據(jù)分析。

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