膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，具有高侵襲性、生長迅速、預(yù)后差等特點，是神經(jīng)外科治療中最棘手的難治性腫瘤之一。臨床上將GBM分為三種亞型：促神經(jīng)元亞型（proneural，PN），經(jīng)典亞型（classical）和間充質(zhì)亞型（mesenchymal，MES）[1-3]。一系列臨床數(shù)據(jù)證實，接受治療后的GBM存活細(xì)胞會從較低侵襲性的PN表型向更高侵襲性且產(chǎn)生治療抗性的MES表型轉(zhuǎn)化[2,4]，從而增大了復(fù)發(fā)風(fēng)險和后續(xù)治療難度。被寄予生存希望的臨床治療反而導(dǎo)致了腫瘤的進(jìn)一步惡化，使得GBM的治療陷入了進(jìn)退兩難的境地。

那到底是什么原因?qū)е铝诉@種現(xiàn)象的發(fā)生？腫瘤的惡化真的是由治療造成的嗎？背后的分子機制又是怎樣？來自伯明翰阿拉巴馬大學(xué)（UAB）的神經(jīng)外科教授Nakano博士的研究也許可以為我們找到問題的答案。

2018年7月份，一篇來自美國、俄羅斯、韓國和中國的聯(lián)合研究小組-Nakano團(tuán)隊的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生凋亡的GBM細(xì)胞通過其誘導(dǎo)和釋放的細(xì)胞外囊泡（apoptotic extracellular vesicles，apoEVs）向鄰近的存活腫瘤細(xì)胞發(fā)送信號，從而促進(jìn)后者的增殖、侵襲性、運動性以及對放射或化學(xué)療法的抗性。接著，研究者鑒定出一個代表性剪接因子—RBM11，該因子在腫瘤治療后出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，并且散布在細(xì)胞凋亡后分泌的細(xì)胞外囊泡中。這些囊泡一旦進(jìn)入受體細(xì)胞，剪接因子RBM11將會改變細(xì)胞內(nèi)MDM4和細(xì)胞周期蛋白D1的剪接方式，導(dǎo)致更具致癌性的細(xì)胞亞型發(fā)生表達(dá)。因此，該機制成為治療原發(fā)性腦癌膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新療法的可能靶標(biāo)，并且可適用于其他癌癥類型。

該文章以“Apoptotic Cell-Derived Extracellular Vesicles Promote Malignancy of Glioblastoma Via Intercellular Transfer of Splicing Factors”為題發(fā)表于權(quán)威期刊Cancer Cell（IF22.8）[5]，并在可變剪接的研究部分對烈冰自主研發(fā)的可變剪接算法ASD進(jìn)行了引用。

文章思路：

（1）對apoEVs促進(jìn)受體細(xì)胞的增殖、侵襲性和治療抗性進(jìn)行驗證

（2）檢測出apoEVs中含有剪接體蛋白組分

（3）證明該蛋白的傳遞依賴于細(xì)胞的凋亡

（4）通過RNA-seq對受體細(xì)胞中RNA剪接情況進(jìn)行檢測

（5）鎖定目標(biāo)基因RBM11，并對該基因進(jìn)行分子機制驗證

實驗結(jié)果：

1、apoEVs促進(jìn)受體細(xì)胞向侵襲性表型轉(zhuǎn)化

研究者構(gòu)建了小鼠的GBM臨床模型，并通過大量體內(nèi)外生物學(xué)實驗證實，細(xì)胞凋亡導(dǎo)致GBM細(xì)胞分泌出數(shù)量更多且體積更大的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），存活細(xì)胞可以有效捕獲EV。存活細(xì)胞在EV中所包含的某種分泌因子的誘導(dǎo)下，向MES表型轉(zhuǎn)化，從而獲得更強的增殖能力、侵襲力和治療抗性。

Figure 1. 是否暴露于apoEVs中的小鼠生存曲線.

Figure 2. apoEVs促使PN GBM細(xì)胞向MES GBM細(xì)胞轉(zhuǎn)化

2、apoEVs中富含剪接體蛋白和U snRNAs

為了解析apoEVs的分子機制，研究者利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS），分別對未經(jīng)處理的和受到致死輻射的腫瘤中EVs中的蛋白質(zhì)種類進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，在兩組樣本中存在顯著差異的主要有蛋白酶體和剪接體蛋白。剪接體蛋白通常與尿嘧啶富集的非編碼小RNA（U snRNAs）結(jié)合形成復(fù)合物，qRT-PCR顯示apoEVs中富含所有類型的剪接體U snRNAs復(fù)合物。

Figure 3. apoEVs中富含剪接體蛋白和U snRNAs

3、剪接體蛋白的傳遞依賴細(xì)胞凋亡蛋白酶

細(xì)胞凋亡蛋白酶的活化促使凋亡GBM細(xì)胞將剪接體蛋白從細(xì)胞核中釋放出來，然后由apoEVs封裝進(jìn)入囊泡，繼而排出細(xì)胞，這可能是剪接體發(fā)生細(xì)胞間傳遞的可能機制之一。

Figure 4. 剪接體蛋白的傳遞依賴細(xì)胞凋亡蛋白酶

4、apoEVs誘導(dǎo)受體細(xì)胞中發(fā)生類似MES的剪接形式改變

發(fā)現(xiàn)apoEVs中的剪接體成分之后，研究者開始懷疑受體細(xì)胞中的表型改變是否是由RNA的可變剪接造成的？

為了驗證這一猜想，研究者分別對未經(jīng)處理的MES GBM細(xì)胞和PN GBM細(xì)胞，加入apoEVs的PN GBM細(xì)胞和加入空白對照介質(zhì)的PN GBM細(xì)胞，以及加入apoEVs后又將其過濾掉的PN GBM細(xì)胞，進(jìn)行了雙端100bp的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）。測序結(jié)果顯示apoEVs對mRNA的剪切模式產(chǎn)生了重要影響。

對不同分組間的可變剪接事件（alternative splicing events，ASEs）進(jìn)行維恩分析，超過30%的ASEs受到apoEVs的影響，而這些ASEs恰恰與MES GBM的治療抗性相關(guān)。GO分析顯示，apoEVs誘導(dǎo)的ASE會對調(diào)控DNA損傷修復(fù)和壓力回應(yīng)的基因產(chǎn)生影響。

Figure 5. （A-B）apoEVs誘導(dǎo)的ASE會對調(diào)控DNA損傷修復(fù)和壓力回應(yīng)的基因產(chǎn)生影響

為了檢測apoEVs對受體細(xì)胞基因表達(dá)的影響，研究者將加入apoEVs的GBM157細(xì)胞培養(yǎng)4天之后進(jìn)行了RNA-Seq，結(jié)果顯示apoEVs的加入使得PN表型的marker基因表達(dá)下調(diào)，而MES表型的marker基因表達(dá)上調(diào)。

Figure 5. （D）apoEVs使得PN表型的marker基因表達(dá)下調(diào)，而MES表型的marker基因表達(dá)上調(diào)

內(nèi)源性剪接抑制劑pladienolide B可抑制GBM細(xì)胞的生長，apoEVs則可以解除剪接抑制劑的抑制作用。

Figure 5. （E-F）apoEVs則可以解除剪接抑制劑的抑制作用

5、RBM11參與了apoEVs介導(dǎo)的受體細(xì)胞的表型改變

通過對一些目標(biāo)基因的表達(dá)量比較，研究者鎖定了一個在MES GBM細(xì)胞中特異性存在的剪接因子RBM11作為核心基因，該基因在受體存活細(xì)胞中不存在，而在細(xì)胞發(fā)生凋亡時顯著上調(diào)，符合上文中研究者對分子機制的推測。

研究人員發(fā)現(xiàn)，外源性RBM11引起受體細(xì)胞內(nèi)源性RBM11的上調(diào)和糖酵解的活化。RBM11的過度表達(dá)增加了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移。他們還發(fā)現(xiàn)RBM11改變了RNA剪接，從而產(chǎn)生促進(jìn)DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)cyclinD1的異構(gòu)體和具有顯著更高的抗凋亡活性的蛋白質(zhì)MDM4的異構(gòu)體。這些變化可以使細(xì)胞更耐受治療。對癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫的檢查表明，這兩種異構(gòu)體的表達(dá)升高與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良有關(guān)。

最后，該團(tuán)隊研究了來自匹配患者的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤的成對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本。在43對匹配樣品中的大部分中，與原始未治療的腫瘤相比，復(fù)發(fā)性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的RBM11蛋白水平明顯更高。在另外兩個患者隊列中，他們發(fā)現(xiàn)RBM11水平越高，膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生存率越差。

Figure 6. RBM11對RNA剪接的調(diào)控與細(xì)胞周期和細(xì)胞死亡有關(guān)

綜上，該研究揭示了基于apoEVs介導(dǎo)的剪接體蛋白轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞通訊機制。這種機制很可能適用于GBM以外的癌癥類型。 在臨床應(yīng)用中，該研究數(shù)據(jù)可以為RNA剪接事件或特異性剪接因子的分子靶標(biāo)提供論據(jù)，以減輕GBM治療后發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可能。

------------------------------------------可變剪接算法---------------------------------------------------

可變剪接一直是疾病分子機制研究的熱點之一，Nakano團(tuán)隊的研究則再次使其成為研究者們視線的焦點。數(shù)據(jù)分析起家的烈冰很早便開始關(guān)注可變剪接，早在2014年即自主研發(fā)了選擇性剪接分析軟件（ASD，Alternative Splicing Detector，網(wǎng)址：http://m.nimdoo.com/asd/ASD.html），相關(guān)文章發(fā)表于權(quán)威期刊Nucleic Acids Research（IF=10.162）[6]。

2017年4月6號，烈冰研發(fā)總監(jiān)宗杰博士率生物信息研發(fā)團(tuán)隊，在ASD的基礎(chǔ)上，開發(fā)出“進(jìn)階級”可變剪接分析算法CASH（Comprehensive AS Hunting，網(wǎng)址：https://sourceforge.net/projects/cash-program/）以“CASH: a constructing comprehensive splice site method for detecting alternative splicing events”為題在線發(fā)表于生物信息類期刊Briefings in Bioinformatics（IF=5.134）。通過與Cuffdiff，MISO，DEXSeq和rMATS等已有算法進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，無論在有生物學(xué)重復(fù)還是無生物學(xué)重復(fù)樣本中，CASH都顯著提升了樣本之間差異可變剪接事件的檢測能力，尤其是新的可變剪接事件，驗證準(zhǔn)確率高達(dá)70%！在針對不同測序深度數(shù)據(jù)的測試中，CASH始終表現(xiàn)出優(yōu)于其他算法的檢測率。即使是在低數(shù)據(jù)量下，CASH依舊力壓其他算法，始終維持著極高的敏感性及特異性。

這是繼ASD算法后，烈冰生物發(fā)表的第二篇可變剪接檢測算法類文章，創(chuàng)下業(yè)內(nèi)同類算法的又一里程碑，在創(chuàng)新型企業(yè)自主研發(fā)算法攻堅之路上再下一城！

這兩種算法在發(fā)布后即被大量文獻(xiàn)引用，其中不乏Nature Communications、PloS Genetics 等高分期刊。此次ASD算法被Nakano團(tuán)隊引用更是對我們莫大的支持和肯定，烈冰會繼續(xù)在自己擅長的生物信息分析領(lǐng)域深耕細(xì)作，推出更多更高質(zhì)的產(chǎn)品和生信分析工具，憑借實力助力廣大科研工作者的科學(xué)研究。

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參考文獻(xiàn)：

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5. Pavlyukov et al., Apoptotic Cell-Derived Extracellular Vesicles Promote Malignancy of Glioblastoma Via Intercellular Transfer of Splicing Factors, Cancer Cell (2018), https://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.05.012.

6、Zhou X, et al. Transcriptome analysis of alternative splicing events regulated by SRSF10 reveals position-dependent splicing modulation. Nucleic Acids Res. 2014 Apr;42(6):4019-30.