多原發(fā)肺癌(Multiple primary lung cancer, MPLC)是一種具有獨(dú)特診斷和治療策略的肺癌亞型，雖然新輔助免疫治療在早期非小細(xì)胞肺癌中顯示可顯著提高患者生存率，但仍然只有一小部分晚期疾病患者對(duì)免疫治療有反應(yīng)；此外，由于目前尚無報(bào)道試驗(yàn)評(píng)估新輔助免疫治療MPLC的可行性，這種方法是否能使多原發(fā)性病變患者受益仍不清楚。

2021年3月，廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所團(tuán)隊(duì)在《Journal For Immunotherapy Of Cancer》（IF=10.252）發(fā)表了一篇題為“Multiomics analysis reveals a distinct response mechanism in multiple primary lung adenocarcinoma after neoadjuvant immunotherapy”的研究成果，該研究對(duì)1例進(jìn)行了3個(gè)周期派姆單抗治療（pembrolizumab）的早期MPLC患者進(jìn)行多組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)患者不同結(jié)節(jié)間表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的基因組表型和免疫原性差異，還揭示了Trm浸潤增加可能是PD-1阻斷后早期免疫反應(yīng)的一個(gè)獨(dú)特標(biāo)記，這些都對(duì)MPLC的診斷治療方案和預(yù)后標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)開拓了思路。

烈冰生物參與了本研究的單細(xì)胞測(cè)序和生物信息數(shù)據(jù)分析工作。

01 樣本信息

02 技術(shù)手段

多色熒光免疫組化（mIHC）

全外顯子測(cè)序

T細(xì)胞受體庫（TCR）測(cè)序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

03 結(jié)果解析

1、 結(jié)節(jié)間基因組異質(zhì)性及T細(xì)胞受體多樣性分析

研究者首先對(duì)三個(gè)切除的結(jié)節(jié)進(jìn)行了全外顯子測(cè)序和TCR測(cè)序，識(shí)別出不同結(jié)節(jié)間高度異質(zhì)性的基因組特征。對(duì)免疫治療無反應(yīng)的W1/W3均存在EGFR 21號(hào)外顯子 L858R突變，而W2在KRAS中存在致癌驅(qū)動(dòng)突變。此外，HLA表型預(yù)測(cè)也表現(xiàn)出結(jié)節(jié)間高度異質(zhì)，W2中存在特異性T細(xì)胞增殖，克隆性更高但TCR多樣性更低。

2、 腫瘤細(xì)胞間差異性分析

然后，研究者利用單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)的inferCNV篩選出腫瘤細(xì)胞，通過差異基因分析、基因集富集分析（GSEA）、GO分析，表征出W2和W1/W3癌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因。發(fā)現(xiàn)W2腫瘤中HLA相關(guān)基因、補(bǔ)體激活及免疫相關(guān)基因均顯著上調(diào)，并參與了T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和其他T細(xì)胞激活過程的正向調(diào)節(jié)。而W1/W3癌細(xì)胞中則是與細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，且生長(zhǎng)因子信號(hào)受體轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞增殖的GO條目更為顯著，這些也在一定程度上解釋了免疫治療的有限反應(yīng)應(yīng)答。

3、 免疫微環(huán)境差異性分析

由于PD-1檢查點(diǎn)抑制劑針對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療的機(jī)制，且三個(gè)結(jié)節(jié)CD20（B細(xì)胞marker）染色均顯示已形成三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)，于是，研究者再次評(píng)估了有反應(yīng)和無反應(yīng)結(jié)節(jié)間免疫細(xì)胞的差異。研究發(fā)現(xiàn)，Trm亞群在W2樣本中顯著富集，且特異性高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)基因，如LAG3、PDCD1、CTLA4、TIGIT和HLA-A。為了解析免疫治療對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞的演化影響，研究者進(jìn)行了擬時(shí)序分析，發(fā)現(xiàn) W2細(xì)胞傾向于fate 2，與T細(xì)胞衰竭和細(xì)胞毒性信號(hào)相關(guān)（高表達(dá)HAVCR2、TIGIT、PDCD1、GNLY、HLA-A和GZMB）。W1/W3細(xì)胞傾向于fate 1，表現(xiàn)為GZMH、HLA-DRA和IFNG的高表達(dá)。最后，研究者利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表數(shù)據(jù)集，評(píng)估了Trm特征的預(yù)測(cè)和預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)高Trm浸潤的患者總生存期更長(zhǎng)，揭示Trm在多種癌癥類型中既是免疫浸潤的預(yù)測(cè)因子，也是預(yù)后因子。

總之，該研究提示不同病變之間的基因組和免疫微環(huán)境存在差異可能會(huì)影響腫瘤治療效果，還揭示Trm浸潤增加可能是免疫治療的早期反應(yīng)信號(hào)和預(yù)后的獨(dú)特標(biāo)志，這些都對(duì)未來免疫治療的生物標(biāo)志物研究具有重要的意義。

針對(duì)治療前后、治療效果存在差異的樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，有助于我們挖掘藥物治療與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系，為腫瘤的精準(zhǔn)治療以及藥物的開發(fā)提供強(qiáng)有力依據(jù)。

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