既往研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變型肺腺癌（EGFR-LUAD）的PD-L1表達(dá)和腫瘤突變負(fù)荷（TMB）都較低，免疫治療療效不佳。而針對(duì)該疾病的免疫微環(huán)境（TME）尚不清楚，這都為EGFR-LUAD的治療增加了難度。

本期，小編為您帶來一篇廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所周清教授（通訊作者）和楊蕾博士（第一作者）在Journal for ImmunoTherapy of Cancer雜志（IF=13.751）上發(fā)表的文章，題目為“Single-cell transcriptome analysis revealed a suppressive tumor immune microenvironment in EGFR mutant lung adenocarcinoma”。該文章從細(xì)胞成分和功能的角度來揭示EGFR突變型肺腺癌的特異性腫瘤微環(huán)境（TME），為該疾病的免疫治療策略提供了新的思路。

烈冰生物參與了本次單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)和數(shù)據(jù)分析工作，下面請(qǐng)跟隨小編的步伐，來看看這篇文章的研究思路和結(jié)果分析吧~

樣本信息

①8名患者的9個(gè)LUAD腫瘤樣本

EGFR突變（EFGR+）：EGFR未突變（EFGR-）=5：4

其中EGFR-樣本共獲得18704個(gè)細(xì)胞，EGFR+獲得了22095個(gè)細(xì)胞。

②公共數(shù)據(jù)庫多原發(fā)性肺腺癌新輔助免疫治療后樣本（n=3）數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析

主要分析方法

細(xì)胞聚類分析，差異基因表達(dá)分析，擬時(shí)序分析，細(xì)胞通訊分析，GO Pathway分析，多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC）等

單細(xì)胞捕獲平臺(tái)

BD Rhapsody

研究結(jié)果解析

基于NovelBrain生信分析平臺(tái)的分析，將獲得的40,799個(gè)單細(xì)胞確定為8種主要的細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、T/自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、B/漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞。此外，細(xì)胞注釋和占比統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，EGFR突變型和野生型樣本的細(xì)胞類型占比存在顯著的差異，其中T/NK細(xì)胞在兩類腫瘤中的數(shù)量和占比相似，EGFR+樣本中存在更多的單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，而EGFR-組的中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞比例更高。

針對(duì)上皮細(xì)胞，采用sub-Cluster分析將9067個(gè)上皮細(xì)胞分為13個(gè)亞群，進(jìn)一步采用inferCNV分析將其分為惡性上皮和非惡性上皮兩類，而差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，CCL18, CXCL1和CXCL3在EGFR+組的惡性上皮細(xì)胞中表達(dá)水平更高，可能參與巨噬細(xì)胞分化和招募Treg細(xì)胞；IL-7和IL-8等基因在EGFR-組的表達(dá)相對(duì)更高，說明相較于EGFR+組，EGFR-的惡性上皮可能更容易促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖。

此外，研究團(tuán)隊(duì)為了驗(yàn)證上皮細(xì)胞對(duì)于免疫治療產(chǎn)生的影響，下載了公共數(shù)據(jù)集中免疫治療后的單細(xì)胞測(cè)序樣本數(shù)據(jù)，針對(duì)數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，EGFR+組的上皮細(xì)胞與免疫治療無效樣本的上皮特征相似，而EGFR -組與治療有效樣本的上皮特征相似，即EGFR+肺腺癌可能對(duì)免疫治療的反應(yīng)較差。進(jìn)一步的上皮細(xì)胞擬時(shí)序分析表明，EGFR的突變導(dǎo)致了正常上皮細(xì)胞分化差異，而beam分析表明，EGFR+組的惡性上皮具有更多與代謝途徑相關(guān)的基因（如糖酵解、氨基酸代謝等）,可能抑制了CD8+ T在內(nèi)的T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的功能。

對(duì)T細(xì)胞的細(xì)分發(fā)現(xiàn)，CD8+組織駐留記憶細(xì)胞（CD8+ TRM）和CD8+增殖T細(xì)胞（CD8+cycling T）主要存在于EGFR-組中，且檢測(cè)到CXCL13基因（參與促進(jìn)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)生成）的表達(dá)，而EGFR+組中基本沒有表達(dá)，說明EGFR+組缺乏CD8+TRM且無法分泌CXCL13促進(jìn)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的生成。此外，差異基因表達(dá)分析還發(fā)現(xiàn)多種免疫檢查點(diǎn)（PDCD1、TNFRSF9和ICOS等）在EGFR-組的表達(dá)，而EGFR+組中很少但高表達(dá)一些免疫抑制因子（CCL4、IL-1β等），以上分析結(jié)果也得到了mIHC的驗(yàn)證，說明EGFR突變肺腺癌更難形成對(duì)免疫治療有利的免疫微環(huán)境。

此外，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CCL2、CCL13、GDF15和CXCL17高表達(dá)于EGFR+組中，這些細(xì)胞因子多與抑制免疫的微環(huán)境相關(guān)。相比之下，EGFR-組中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）可能通過表達(dá)CXCL9來招募TRM細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤浸潤效果。進(jìn)一步的細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是整個(gè)細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中CHIT1_TAM亞群可能在EGFR-組的腫瘤微環(huán)境中具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，以直接和間接地介導(dǎo)TRM的激活和駐留，而在EGFR+肺腺癌中缺失相關(guān)的TAMs。相似的，EGFR+組也缺失相關(guān)CAF，無法誘導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD8+ TRM細(xì)胞，即EGFR突變肺腺癌因缺失TAM和CAF，導(dǎo)致無法招募、駐留和擴(kuò)展CD8+TRM細(xì)胞，進(jìn)而無法形成三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)。

最后，基于CD8+ TRM的重要性，研究團(tuán)隊(duì)采用細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)，CD8+ TRM與成纖維細(xì)胞和CHIT1_TAM等細(xì)胞存在相互作用，如成纖維細(xì)胞通過TGFB2-TGFBR2 和 TGFB3-TGFBR3 配受體的結(jié)合，促進(jìn)了CD8+ T轉(zhuǎn)化為CD8+TRM細(xì)胞。此外，與EGFR野生型肺腺癌相比，EGFR突變型腫瘤的T細(xì)胞和其他細(xì)胞類型之間的多種免疫檢查點(diǎn)相關(guān)互作通訊顯著減少（如PD-1和PD-L1），而缺乏CD8+ TRM很可能是導(dǎo)致其形成腫瘤免疫抑制型微環(huán)境的關(guān)鍵因素。

全文總結(jié)

研究團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞測(cè)序聯(lián)合公共數(shù)據(jù)分析、多重?zé)晒饷庖呓M化驗(yàn)證等方法，探索了單細(xì)胞水平上EGFR突變肺腺癌的免疫微環(huán)境景觀：多種細(xì)胞成分可能通過影響CD8+ TRM抑制了EGFR突變LUAD的特異性腫瘤微環(huán)境，即CD8+TRM的缺陷可能是EGFR突變型LUAD抑制性TME的關(guān)鍵因素。這也為EGFR突變肺腺癌的聯(lián)合免疫治療提供了新的思路。

原文鏈接：

http://dx.doi.org/10. 1136/jitc-2021-003534